Способ получения радиотрейсера на основе модифицированной адресной молекулы белковой природы и технеция-99m и оценка его специфичности in vitro для диагностики онкомаркера Her2
| Parent link: | Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация/ Воронежский государственный университет.— , 2004- № 3.— 2020.— [С. 97-103] |
|---|---|
| Other Authors: | , , , , , , , , |
| Summary: | Заглавие с экрана Наличие гиперэкспрессии онкомаркера HER2 выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке молочной железы, легкого, яичников, желудка, простаты и др. Новый класс адресных молекул неиммуноглобулиновой природы DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), являющихся специфичными к раковоассоциированному антигену HER2, предлагается для радионуклидной диагностики этого антигена. Ранее мы предложили способ модификации адресных молекул белковой природы (DARPin9_29) с применением хелатирующего агента сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата (DPAH-NHS) для эффективного связывания 99mTc. В настоящем исследовании были подобраны оптимальные условия радиосинтеза и предложена двухстадийная методика мечения 99шТс DPAH-DARPin9_29. Оптимизация методики мечения заключалась в подборе оптимального времени инкубации и температуры, а также в оптимальном соотношении количеств белка и комплекса 99mTc(CO)3. Радиохимический выход и радиохимическую чистоту радиотрейсера оценивали тонкослойной радио-хроматографией на полосках iTLC-бумаги в фосфатно-буферном растворе. При оптимизации методики установлено, что в условиях инкубации (60 мин при 60 °C) на 50 мкг белка необходимо 50 мкл раствора 99mTc(CO)3 (с активностью 100-200 МБк). Радиохимический выход радиотрейсера 99mTc-DPAH-DARPin9_29 составил более 83 % (изолированный выход более 70 %) при чистоте свыше 96 % после очистки гель-фильтрацией c G25. При этом была доказана высокая стабильность радиотрейсера (чистота более 97 %) после инкубации с 5000-кратным молярным избытком Z-гистидина в течение 6 часов. Изучение специфичности in vitro 99mTc-DPAH-DARPin9_29 выполняли на клеточных линиях с различным уровнем экспрессии HER2: SKOV-3 > BT-474. Блокирование рецептора HER2 проводили путем добавления 100-кратного молярного избытка немеченого DARPin9_29 в половину чашек Петри каждой клеточной линии с последующей инкубацией в течение 60 минут при температуре 37 °С. Установлено, что накопление радиотрейсера пропорционально уровню экспрессии HER2 в клетках, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого белка отмечается значительное снижение связывания радиотрейсера в обеих группах клеток. The presence of overexpression of the HER2 tumor marker is detected on the surface of tumor cells in cancer of the breast, lung, ovary, stomach, prostate, etc. A new class of targeted molecules of non-immunoglobulin nature DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), which are specific for the cancer-associated HER2 antigen, is proposed for radionuclide diagnosis of this antigen. Earlier, we proposed a method for preparation the targeted protein molecule DARPin9_29 derivate (DPAH-DARPin9_29) using the chelating agent succinimid-1-yl 6- (bis (pyridin-2-ylmethyl) amino)hexanoate for efficient binding of 99mTc. In this study, the optimal conditions for radiosynthesis were selected and a two-stage 99mTc labeling method DPAH-DARPin9_29 was proposed. The optimization of the labeling technique consisted in the selection of the optimal incubation time and temperature, as well as in the optimal ratio of protein to complex 99mTc(CO)3. Radiochemical yield and purity were measured using radio-iTLC in PBS. It was found that, under incubation conditions (60 min at 60 °C), 50 pl of a 99mTc(CO)3 solution (with an activity of 100-200 MBq) is necessary for 50 pg of protein. The radiochemical yield of radiotracer 99mTc-DPAH-DARPin9_29 was over 83 % (isolated yield about 70 %), the radiochemical purity after gel-filtration purification was over 96 %. The stability of 99mTc-DPAH-DARPin9_29 has been proven in accordance with a 5,000-fold mol excess of Z-histidine. Binding specificity of 99mTc-labeled DPAH-DARPin9_29 to HER2 was evaluated using HER2-expressing SKOV3 and BT474 cells. To saturate HER2 receptors, a 100-fold excess of non-labeled DARPin9_29 (100-fold mol excess) was added to the control group of cells. In vitro studies showed that the accumulation of 99mTc-DPAH-DARPin9_29 was directly proportional to the level of HER2 expression in cells (SKOV-3 > BT-474), while blocking the receptors with an excess of unlabeled protein showed a significant reduction in binding in the group of cells. |
| Published: |
2020
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://www.elibrary.ru/item.asp?id=44142072 http://www.vestnik.vsu.ru/pdf/chembio/2020/03/2020-03-13.pdf |
| Format: | Electronic Book Chapter |
| KOHA link: | https://koha.lib.tpu.ru/cgi-bin/koha/opac-detail.pl?biblionumber=662968 |