In vitro и in vivo оценка радиохимического соединения на основе меченного 99тТС каркасного белка DARPIN9_29 для молекулярной визуализации злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/NEU
| Parent link: | Медицинская радиология и радиационная безопасность.— , 1956- Т. 65, № 1.— 2020.— [С. 37-41] |
|---|---|
| Rannpháirtithe: | , , , , , , , , , , |
| Achoimre: | Заглавие с экрана Для обеспечения направленной доставки радионуклидов при диагностике злокачественных новообразований активно используют молекулы, связывающиеся со специфическим «таргетным» антигеном. В последние годы исследуется возможность применения для этих целей адресных молекулярных структур DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein). Одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, гиперэкспрессия которого определяется на поверхности опухолевых клеток. Цель: Изучение эффективности радиохимического соединения на основе меченных 99mTc адресных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu. Материал и методы: Последовательность DARPin9_29 была амплифицирована с плазмиды pET-DARP-6HIS для экспрессии гена DARPin9_29-His6 в клетках E. coli. Элюат 99mTcO4- (400-500 мкл, 4 ГБк) был добавлен в набор для приготовления трикарбонила технеция [99mTc(H2O)3(CO)3]+ (CRS Kit, Швейцария) с последующей инкубацией при температуре 100 °С в течение 20 мин. После инкубации 40 мкл [99mTc(H2O)3(CO)3]+ было добавлено к 168 мкг DARPin9_29 в 100 мкл PBS (натрий-фосфатный буфер) с последующей инкубацией при температуре 40 °С в течение 60 мин. Радиохимические выход и чистота определялись с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), очищение проводилось с использованием очищающих колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Для изучения специфичности исследуемого радиофармацевтического соединения использовались клеточные линии с различным уровнем экспрессии Her2/neu: SKOV-3 > BT474 >> DU-145. Для проведения in vitro исследования использовалась экспрессирующая Her2/neu клеточная линия SKOV-3. Исследование проводилось через 6 ч после введения препарата. Результаты: Радиохимический выход составил 72 ± 8 %, радиохимическая чистота после очищения - 98,7 ± 1,0 %. Показатели стабильности в растворе PBS через 1 ч составили 99,8 ± 0,2; через 3 ч - 98,2 ± 0,1. Данные in vitro исследований продемонстрировали, что накопление изучаемого соединения прямо пропорционально уровню экспрессии Her2/neu клеток, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого протеина отмечается значительное снижение связывания в группе клеток. Данные по биораспределению и ОФЭКТ/КТ в организме животного BALB/c nu/nu через 6 ч после введения радиофармпрепарата продемонстрировали быстрое выведение соединения из кровотока и высокую аккумуляцию в опухоли, печени, почках и мочевом пузыре. Заключение: Проведенные исследования продемонстрировали высокие показатели радиохимического выхода и чистоты, а также стабильность изучаемого соединения. Результаты in vitro и in vivo анализа показали специфичность и аффинность радиофармпрепарата к рецептору Her2/neu на поверхности опухолевых клеток. Выявленная при in vivo исследованиях высокая аккумуляция препарата в печени и почках, вероятно, обусловлена липофильностью 99mTc(CO)3 -, связанной с гексагистидиновым концом, и свидетельствует об ограничении его дальнейшего клинического использования в оценке состояния указанных выше органов, что потребует дополнительных методов диагностики, а также возможной модификации химической структуры. Purpose: Evaluation of a radiopharmaceutical based on 99mTc-labeled targeted molecules DARPin9_29 for radionuclide diagnostics of malignancies with Her2/neu overexpression. Material and methods: The DARPin9_29 sequence was amplified from the plasmid pET-DARP-6HIS for the DARPin9_29-His6 gene expression in E. coli cells. The eluent of 99mTcO4 - (400-500 µl, 4 GBq) was added to the kit and incubated at a temperature of 100 °C for 20 minutes. After incubation, 40 µl of tricarbonyl technetium was added to 168 µg of DARPin9_29 in 100 µl of PBS (sodium phosphate buffer), followed by incubation at 40 °C for 60 minutes. The radiochemical yield and purity were determined by thin layer radiochromatography, the purification was performed using NAP-5 cleansing columns (GE Healthcare). Cell lines with different levels of Her2/neu expression were used: SKOV-3> BT474 >> DU-145 for the determination of the radiopharmaceutical specificity. Her2/neu expressing cell line SKOV-3 was used for in vitro study. The study was conducted 6 hours after the administration of the drug. Results: The radiochemical yield was 72 ± 8 %, the radiochemical purity after purification was 98.7 ± 1.0 %. The stability in PBS (phosphate buffered saline) solution after 1 hour was 99.8 ± 0.2; after 3 hours - 98.2 ± 0.1. In vitro studies showed that the accumulation of explored compound was directly proportional to the level of Her2/neu expression in cells, while blocking the receptors with an excess of unlabeled protein showed a significant reduction in binding in the group of cells. Data on biodistribution and SPECT/CT in the body of the animal BALB/c nu/nu demonstrated rapid removal of the compound from the blood stream and high accumulation in the liver, kidney and bladder 6 hours after the introduction of the radiopharmaceutical. Conclusion: The studies demonstrated high radiochemical yields and purity, as well as stability of the studied compound. The results of in vitro and in vivo analysis showed the specificity and affinity of the radiopharmaceutical to the Her2/neu receptor on the surface of tumor cells. The high accumulation of the drug in the liver and kidneys, detected in in vivo studies, is probably due to the lipophilicity of the 99mTc(CO)3-histidine tag and indicates the limitation of its further clinical use in assessing the condition of the above organs, which will require additional diagnostic methods, as well as possible modification chemical structure. Режим доступа: по договору с организацией-держателем ресурса |
| Foilsithe / Cruthaithe: |
2020
|
| Ábhair: | |
| Rochtain ar líne: | https://doi.org/10.12737/1024-6177-2020-65-1-37-41 |
| Formáid: | Leictreonach Caibidil leabhair |
| KOHA link: | https://koha.lib.tpu.ru/cgi-bin/koha/opac-detail.pl?biblionumber=663256 |
| Achoimre: | Заглавие с экрана Для обеспечения направленной доставки радионуклидов при диагностике злокачественных новообразований активно используют молекулы, связывающиеся со специфическим «таргетным» антигеном. В последние годы исследуется возможность применения для этих целей адресных молекулярных структур DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein). Одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, гиперэкспрессия которого определяется на поверхности опухолевых клеток. Цель: Изучение эффективности радиохимического соединения на основе меченных 99mTc адресных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu. Материал и методы: Последовательность DARPin9_29 была амплифицирована с плазмиды pET-DARP-6HIS для экспрессии гена DARPin9_29-His6 в клетках E. coli. Элюат 99mTcO4- (400-500 мкл, 4 ГБк) был добавлен в набор для приготовления трикарбонила технеция [99mTc(H2O)3(CO)3]+ (CRS Kit, Швейцария) с последующей инкубацией при температуре 100 °С в течение 20 мин. После инкубации 40 мкл [99mTc(H2O)3(CO)3]+ было добавлено к 168 мкг DARPin9_29 в 100 мкл PBS (натрий-фосфатный буфер) с последующей инкубацией при температуре 40 °С в течение 60 мин. Радиохимические выход и чистота определялись с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), очищение проводилось с использованием очищающих колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Для изучения специфичности исследуемого радиофармацевтического соединения использовались клеточные линии с различным уровнем экспрессии Her2/neu: SKOV-3 > BT474 >> DU-145. Для проведения in vitro исследования использовалась экспрессирующая Her2/neu клеточная линия SKOV-3. Исследование проводилось через 6 ч после введения препарата. Результаты: Радиохимический выход составил 72 ± 8 %, радиохимическая чистота после очищения - 98,7 ± 1,0 %. Показатели стабильности в растворе PBS через 1 ч составили 99,8 ± 0,2; через 3 ч - 98,2 ± 0,1. Данные in vitro исследований продемонстрировали, что накопление изучаемого соединения прямо пропорционально уровню экспрессии Her2/neu клеток, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого протеина отмечается значительное снижение связывания в группе клеток. Данные по биораспределению и ОФЭКТ/КТ в организме животного BALB/c nu/nu через 6 ч после введения радиофармпрепарата продемонстрировали быстрое выведение соединения из кровотока и высокую аккумуляцию в опухоли, печени, почках и мочевом пузыре. Заключение: Проведенные исследования продемонстрировали высокие показатели радиохимического выхода и чистоты, а также стабильность изучаемого соединения. Результаты in vitro и in vivo анализа показали специфичность и аффинность радиофармпрепарата к рецептору Her2/neu на поверхности опухолевых клеток. Выявленная при in vivo исследованиях высокая аккумуляция препарата в печени и почках, вероятно, обусловлена липофильностью 99mTc(CO)3 -, связанной с гексагистидиновым концом, и свидетельствует об ограничении его дальнейшего клинического использования в оценке состояния указанных выше органов, что потребует дополнительных методов диагностики, а также возможной модификации химической структуры. Purpose: Evaluation of a radiopharmaceutical based on 99mTc-labeled targeted molecules DARPin9_29 for radionuclide diagnostics of malignancies with Her2/neu overexpression. Material and methods: The DARPin9_29 sequence was amplified from the plasmid pET-DARP-6HIS for the DARPin9_29-His6 gene expression in E. coli cells. The eluent of 99mTcO4 - (400-500 µl, 4 GBq) was added to the kit and incubated at a temperature of 100 °C for 20 minutes. After incubation, 40 µl of tricarbonyl technetium was added to 168 µg of DARPin9_29 in 100 µl of PBS (sodium phosphate buffer), followed by incubation at 40 °C for 60 minutes. The radiochemical yield and purity were determined by thin layer radiochromatography, the purification was performed using NAP-5 cleansing columns (GE Healthcare). Cell lines with different levels of Her2/neu expression were used: SKOV-3> BT474 >> DU-145 for the determination of the radiopharmaceutical specificity. Her2/neu expressing cell line SKOV-3 was used for in vitro study. The study was conducted 6 hours after the administration of the drug. Results: The radiochemical yield was 72 ± 8 %, the radiochemical purity after purification was 98.7 ± 1.0 %. The stability in PBS (phosphate buffered saline) solution after 1 hour was 99.8 ± 0.2; after 3 hours - 98.2 ± 0.1. In vitro studies showed that the accumulation of explored compound was directly proportional to the level of Her2/neu expression in cells, while blocking the receptors with an excess of unlabeled protein showed a significant reduction in binding in the group of cells. Data on biodistribution and SPECT/CT in the body of the animal BALB/c nu/nu demonstrated rapid removal of the compound from the blood stream and high accumulation in the liver, kidney and bladder 6 hours after the introduction of the radiopharmaceutical. Conclusion: The studies demonstrated high radiochemical yields and purity, as well as stability of the studied compound. The results of in vitro and in vivo analysis showed the specificity and affinity of the radiopharmaceutical to the Her2/neu receptor on the surface of tumor cells. The high accumulation of the drug in the liver and kidneys, detected in in vivo studies, is probably due to the lipophilicity of the 99mTc(CO)3-histidine tag and indicates the limitation of its further clinical use in assessing the condition of the above organs, which will require additional diagnostic methods, as well as possible modification chemical structure. Режим доступа: по договору с организацией-держателем ресурса |
|---|---|
| DOI: | 10.12737/1024-6177-2020-65-1-37-41 |